Western Blot Fehlerbehebung

Lösen Sie Ihre Western-Blot-Probleme mit diesen Tipps zur Fehlerbehebung, die häufige Ursachen für kein Signal, hohen Hintergrund, mehrere Bänder und mehr abdecken.

1. Kein Signal
2. Hoher Hintergrund.
3. Mehrere Bands.
4. Ungleichmäßige weiße "Flecken" auf dem Fleck.
5. Schwarze Punkte auf dem Fleck.
6. Weiße Bänder auf einem schwarzen Fleck.
7. Die Molekulargewichtsmarkierungsspur ist schwarz.

1. Warum funktioniert mein Western Blot nicht??
2. Warum ist mein Western Blot verschmiert??
3. Was verursacht unspezifische Bindung im Western Blot?
4. Waschen Sie sich nach dem Blockieren des Western Blot??
5. Wie kann ich meine Western-Blot-Ergebnisse verbessern??
6. Warum verwenden wir Milch im Western Blot??
7. Warum gibt es im Western Blot mehrere Bands??
8. Was sind die Schritte des Western Blots??
9. Können Sie einen Western Blot übertragen??
10. Wie reduziert man unspezifische Banden im Western Blot??
11. Was bedeuten die Bands im Western Blot??
12. Wie verhindern Sie den Proteinabbau im Western Blot??

Warum funktioniert mein Western Blot nicht??

Die Fehlerbehebung bei einem Blot (wie alles in der Wissenschaft) muss methodisch erfolgen. ... Beispielsweise; Die von Ihnen verwendete Proteinkonzentration reicht nicht aus, Sie verwenden den falschen Probenpuffer, das Blotting lief nicht gut, der von Ihnen verwendete Antikörper funktioniert nicht oder Sie verwenden ihn in einer falschen Konzentration.

Warum ist mein Western Blot verschmiert??

Es könnte kein Problem mit dem Gel geben, da der Marker intakte Banden aufweist. Vielleicht könnte es ein Problem mit dem Protein geben, es könnte abgebaut worden sein oder mit einer positiven Probe überprüft werden. ... Verwenden Sie weniger Protein und / oder versuchen Sie eine Immunpräzipitation, um Ihr Ziel im Lysat anzureichern. Verdünnen Sie die Antikörperkonzentration.

Was verursacht unspezifische Bindung im Western Blot?

Eine der häufigsten Ursachen für unspezifische Banden ist die unvollständige Blockierung. Blockierungspuffer werden verwendet, um zu verhindern, dass primäre und sekundäre Antikörper an die Membran oder etwas anderes als das interessierende Protein binden.

Waschen Sie sich nach dem Blockieren des Western Blot??

Das Blockieren ist ein sehr wichtiger Schritt in der Immundetektionsphase des Western Blot, da es die unspezifische Bindung des Antikörpers an die Blotmembran verhindert. Nach dem Blockieren wird der Blot in Waschpuffer, üblicherweise TBST, unter leichtem Rühren und in ausreichendem Volumen gespült, um den Blot unter Wasser zu halten. ...

Wie kann ich meine Western-Blot-Ergebnisse verbessern??

Lösung

1. Reduzieren Sie die primäre Antikörperkonzentration.
2. Verringern Sie die Menge des auf das Gel geladenen Gesamtproteins.
3. Passen Sie die Membranblockierungsbedingungen an.
4. Erhöhen Sie die Anzahl der Wäschen.
5. Überprüfen Sie die Spezifität des Antikörpers.
6. Blot mit dem sekundären Antikörper allein.
7. Wenn sich Banden entwickeln, wählen Sie einen alternativen sekundären Antikörper.

Warum verwenden wir Milch im Western Blot??

Das Blockieren ist ein sehr wichtiger Schritt beim Western Blot, da es verhindert, dass Antikörper unspezifisch an die Membran binden. Das Blockieren erfolgt häufig mit 5% BSA oder fettfreier Trockenmilch, die in TBST verdünnt ist, um den Hintergrund zu verringern. ... Der Antikörper kann in einem Waschpuffer wie PBS oder TBST verdünnt werden.

Warum gibt es im Western Blot mehrere Bands??

Mehrere unspezifische Banden auf dem Blot können auf Antikörper von schlechter Qualität oder zu hoher Konzentration, unzureichende Blockierung oder unspezifische Bindung aufgrund des Vorhandenseins von SDS zurückzuführen sein.

Was sind die Schritte des Western Blots??

Das Western-Blot-Verfahren und der Nachweisassay umfassen fünf Schritte, nämlich Transfer, Blockierung, Inkubation des Primärantikörpers, Inkubation des Sekundärantikörpers und Proteinnachweis sowie Western-Blot-Analyse.

Können Sie einen Western Blot übertragen??

Mit zunehmender Zeit besteht jedoch die Gefahr einer Überübertragung (Abstreifen, Durchblasen) der Proteine ​​durch die Membran, insbesondere bei niedrigerem Molekulargewicht (<30 kDa) Proteine ​​bei Verwendung von Membranen mit einer größeren Porengröße (0,45 um). Arbeitsablauf des Nass- / Tank-Elektrotransfers von Protein für das Western Blot.

Wie reduziert man unspezifische Banden im Western Blot??

Wenn Sie Probleme mit der unspezifischen Bindung haben, beachten Sie:

1. Erhöhen der Blockierungsbelichtungszeit und / oder -temperatur, bei der Sie blockieren.
2. Verwenden Sie eine höhere Proteinkonzentration in Ihrem Puffer.
3. Hinzufügen von 0,1% Tween zum Puffer.
4. Vergleich mit einem völlig anderen Blockierungspuffer.

Was bedeuten die Bands im Western Blot??

Zunächst misst der Western Blot-Test die Antikörper, die Ihr Körper gegen die Lyme-Infektion bildet. ... In diesem Verwandten war die Band eine "Fingerabdruck" -Band. " Das heißt, Lyme ist der einzige Organismus, der den menschlichen Körper dazu bringt, diesen Antikörper zu produzieren.

Wie verhindern Sie den Proteinabbau im Western Blot??

So bewahren Sie Ihre Proben im Western Blot auf

1. Arbeiten Sie schnell. Schnelles Arbeiten kann potenzielle Schäden an Ihren Proben minimieren, indem einfach weniger Zeit für deren Verschlechterung eingeräumt wird. ...
2. Halte alles kühl. Hitze ist der Feind von Proteinen in Lösung, da Proteasen bei wärmeren Temperaturen aktiv sind. ...
3. Verwenden Sie Proteaseinhibitoren.