Western Blot Technik, Theorie und Fehlerbehebung

1. Was ist das Prinzip des Western Blots??
2. Wie funktioniert der Western Blot Test??
3. Warum ist mein Western Blot verschmiert??
4. Was zeigt die Western-Blot-Analyse??
5. Was ist die Funktion des Western Blot??
6. Was sind die Anwendungen von Western Blot?
7. Was ist, wenn Western Blot negativ ist??
8. Waschen Sie sich nach dem Blockieren des Western Blot??
9. Wie lange dauern Western-Blot-Ergebnisse??
10. Wie kann ich meinen Western Blot verbessern??
11. Warum gibt es im Western Blot mehrere Bands??
12. Wie bestätigen Sie die Übertragung von Proteinbanden vom Gel auf die Membran im Western Blot-Protokoll??

Was ist das Prinzip des Western Blots??

Western Blot (Protein Blot oder Immunoblot) ist ein schneller und empfindlicher Assay zum Nachweis und zur Charakterisierung von Proteinen. Es basiert auf dem Prinzip der Immunochromatographie, bei der Proteine ​​entsprechend ihrem Molekulargewicht in Polyacrylamidgel getrennt werden.

Wie funktioniert der Western Blot Test??

Während des Tests wird eine kleine Blutprobe entnommen und zum Nachweis von HIV-Antikörpern verwendet, nicht des HIV-Virus selbst. Der Western-Blot-Test trennt die Blutproteine ​​und erkennt die spezifischen Proteine ​​(sogenannte HIV-Antikörper), die auf eine HIV-Infektion hinweisen.

Warum ist mein Western Blot verschmiert??

Es könnte kein Problem mit dem Gel geben, da der Marker intakte Banden aufweist. Vielleicht könnte es ein Problem mit dem Protein geben, es könnte abgebaut worden sein oder mit einer positiven Probe überprüft werden. ... Verwenden Sie weniger Protein und / oder versuchen Sie eine Immunpräzipitation, um Ihr Ziel im Lysat anzureichern. Verdünnen Sie die Antikörperkonzentration.

Was zeigt die Western-Blot-Analyse??

Western Blot wird häufig in der Forschung verwendet, um Proteine ​​zu trennen und zu identifizieren. Bei dieser Technik wird eine Mischung von Proteinen durch Gelelektrophorese basierend auf dem Molekulargewicht und somit nach Typ getrennt. ... Da die Antikörper nur an das interessierende Protein binden, sollte nur eine Bande sichtbar sein.

Was ist die Funktion des Western Blot??

Ein Western Blot ist eine Labormethode zum Nachweis spezifischer Proteinmoleküle aus einer Mischung von Proteinen. Diese Mischung kann alle Proteine ​​enthalten, die mit einem bestimmten Gewebe- oder Zelltyp assoziiert sind.

Was sind die Anwendungen von Western Blot?

Gemeinsame Western-Blot-Anwendungen

• Nachweis von Phosphorylierungszuständen von Proteinen. ...
• Nachweis von Änderungen der Proteinspiegel in verschiedenen Behandlungsgruppen. ...
• Erkennen von Änderungen der Proteinspiegel über Zeitpunkte hinweg. ...
• Nachweis von verkürzten Isoformen von Proteinen. ...
• Markierte Proteine ​​erkennen.

Was ist, wenn Western Blot negativ ist??

Ein negativer Western-Blot-Test bedeutet, dass der ELISA-Test ein falsch positiver Test war. Der Western-Blot-Test kann auch unklar sein. In diesem Fall werden weitere Tests durchgeführt. Negative Tests schließen eine HIV-Infektion nicht aus.

Waschen Sie sich nach dem Blockieren des Western Blot??

Das Blockieren ist ein sehr wichtiger Schritt in der Immundetektionsphase des Western Blot, da es die unspezifische Bindung des Antikörpers an die Blotmembran verhindert. Nach dem Blockieren wird der Blot in Waschpuffer, üblicherweise TBST, unter leichtem Rühren und in ausreichendem Volumen gespült, um den Blot unter Wasser zu halten. ...

Wie lange dauern Western-Blot-Ergebnisse??

Der Lyme-Borreliose-Bluttest, Western Blot, wird zum Nachweis von Antikörpern verwendet, die für B-Burgdorferi spezifisch sind. Vorbereitung: Keine besondere Vorbereitung erforderlich. Testergebnisse: 7-10 Tage. Kann aufgrund von Wetter-, Urlaubs- oder Laborverzögerungen länger dauern.

Wie kann ich meinen Western Blot verbessern??

Lösung

1. Reduzieren Sie die primäre Antikörperkonzentration.
2. Verringern Sie die Menge des auf das Gel geladenen Gesamtproteins.
3. Passen Sie die Membranblockierungsbedingungen an.
4. Erhöhen Sie die Anzahl der Wäschen.
5. Überprüfen Sie die Spezifität des Antikörpers.
6. Blot mit dem sekundären Antikörper allein.
7. Wenn sich Banden entwickeln, wählen Sie einen alternativen sekundären Antikörper.

Warum gibt es im Western Blot mehrere Bands??

Mehrere unspezifische Banden auf dem Blot können auf Antikörper von schlechter Qualität oder zu hoher Konzentration, unzureichende Blockierung oder unspezifische Bindung aufgrund des Vorhandenseins von SDS zurückzuführen sein.

Wie bestätigen Sie die Übertragung von Proteinbanden vom Gel auf die Membran im Western Blot-Protokoll??

Proteintransferprotokoll

1. Bereiten Sie die PVDF-Membran vor, indem Sie sie 30 Sekunden lang in Methanol benetzen und dann kurz in destilliertem Wasser einweichen, gefolgt von 1 × Transferpuffer. ...
2. Filterpapiere und Schwämme vor dem Zusammenbau des Transfersandwichs 10 Minuten im Transferpuffer einweichen.