Trypsin-Edta-Zellkulturprotokoll

Verfahren

1. Entfernen Sie das Medium durch Absaugen aus dem Kulturgefäß und waschen Sie die Monoschicht mit einer Ca-freien Salzlösung²⁺ und Mg²⁺ alle Spuren von Serum zu entfernen. ...
2. Geben Sie genügend Trypsin oder Trypsin / EDTA-Lösung in Kulturgefäße, um die Monoschicht der Zellen vollständig zu bedecken, und stellen Sie sie für ~ 2 Minuten in einen Inkubator bei 37 ° C..

1. Wie stellt man eine Trypsin-EDTA-Lösung für die Zellkultur her??
2. Warum Trypsin EDTA in der Zellkultur verwendet wird?
3. Wie erfolgt die Subkultur adhärenter Zellen unter Verwendung von Trypsin EDTA und EDTA allein??
4. Wie taut man Trypsin EDTA auf??
5. Kann Trypsin Zellen abtöten?
6. Was können wir der Kultur hinzufügen, um Trypsin zu hemmen??
7. Kann EDTA Zellen abtöten?
8. Warum hemmt Serum Trypsin??
9. Ist EDTA zelltoxisch?
10. Warum verwenden wir Trypsin??
11. Warum waschen Sie Zellen mit PBS??
12. Warum waschen Sie die Zellen mit PBS, bevor Sie Trypsin hinzufügen??

Wie stellt man eine Trypsin-EDTA-Lösung für die Zellkultur her??

12 bis 15 ml frisches Zellkulturmedium in einen neuen Kolben geben und dieses Medium auf den geeigneten pH-Wert und die richtige Temperatur äquilibrieren. Sammeln Sie die Zellsuspension, zählen und / oder teilen Sie sie und geben Sie die Zellen in den neu vorbereiteten Kolben. Die empfohlenen Subkultivierungsverhältnisse finden Sie im Produktblatt der Zelllinie.

Warum Trypsin EDTA in der Zellkultur verwendet wird?

EDTA wirkt als Metallchelator, der Trypsinlösungen zugesetzt wird, um die Aktivität zu steigern. EDTA wird hinzugefügt, um das Calcium und Magnesium von der Zelloberfläche zu entfernen, wodurch Trypsin spezifische Peptidbindungen hydrolysieren kann. Der Hauptgrund für die Verwendung von EDTA zusammen mit Trypsin besteht darin, die Zell-Zell-Adhäsion zu entfernen.

Wie erfolgt die Subkultur adhärenter Zellen unter Verwendung von Trypsin EDTA und EDTA allein??

Pipettieren Sie Trypsin / EDTA mit ca. 1 ml pro 25 cm2 Oberfläche auf die gewaschene Zellmonoschicht. Den Kolben drehen, um die Monoschicht mit Trypsin zu bedecken. Dekantieren Sie das überschüssige Trypsin. Den Kolben wieder in den Inkubator stellen und 2-10 Minuten ruhen lassen.

Wie taut man Trypsin EDTA auf??

Nehmen Sie die Trypsin / EDTA-Lösung aus dem Lager und legen Sie sie über Nacht bei 2 ° C bis 8 ° C. 2. Übertragen Sie die Flasche in ein Wasserbad mit 37 ° C und rühren Sie die Flasche vorsichtig um, um alle gelösten Stoffe zu mischen. Bewahren Sie die Trypsin / EDTA-Lösung nicht länger als nötig bei 37 ° C auf.

Kann Trypsin Zellen abtöten?

Die Inkubation von Zellen mit einer zu hohen Trypsinkonzentration über einen zu langen Zeitraum schädigt die Zellmembranen und tötet die Zellen ab.

Was können wir der Kultur hinzufügen, um Trypsin zu hemmen??

Trypsin wird durch Serum gehemmt, das die zweiwertigen Kationen wie Calcium und Magnesium liefert, die sowohl beim intra- als auch beim interzellulären Signalprozess eine Rolle spielen, dh bei der Bildung von CAMs. Daher wird dem Behälter normalerweise Serum zugesetzt, sobald sich die Zellen abgelöst haben - dies kann durch Beobachtung unter a bestätigt werden Mikroskop.

Kann EDTA Zellen abtöten?

ein. Verwenden Sie 5 mM EDTA oder höher. HINWEIS: Zu viel EDTA kann Ihre Zellen abtöten. B. Accutase und Accumax sind von Innovative Technologies vertriebene Produkte zur Zelldissoziation, die bei der Aufrechterhaltung von Einzelzellsuspensionen helfen können.

Warum hemmt Serum Trypsin??

Hallo, Trypsin ist eine Endopeptidase, die Proteine ​​verdaut. Während des Trypsinisierungsprozesses werden extrazelluläre Proteine ​​verdaut, was zur Ablösung der Zellen vom Boden des Kulturgefäßes führt. ... Serum enthält viele Proteaseinhibitoren, die Trypsin, hauptsächlich Alpha-1-Antitrypsin, stoppen. Hoffe das hilft!

Ist EDTA zelltoxisch?

Es wurde keine Toxizität beobachtet, wenn die Zellen 100 uM Zn- oder Fe-EDTA ausgesetzt wurden, aber die gleiche Konzentration an Cu-EDTA war so toxisch wie Na-EDTA. Eine kontinuierliche Exposition der Zellkulturen gegenüber 5 uM Na- oder Zn-EDTA für bis zu 7 Wochen ergab keine Hinweise auf Toxizität.

Warum verwenden wir Trypsin??

Trypsin ist ein Enzym, das uns hilft, Protein zu verdauen. Im Dünndarm baut Trypsin Proteine ​​ab und setzt den im Magen begonnenen Verdauungsprozess fort. Es kann auch als proteolytisches Enzym oder Proteinase bezeichnet werden. Trypsin wird von der Bauchspeicheldrüse in einer inaktiven Form namens Trypsinogen produziert.

Warum waschen Sie Zellen mit PBS??

In der Zellkultur ist während des Verschüttens PBS-Waschen erforderlich, um das Medium des Mediums zu entfernen, damit Trypsin die Zellen von der Platte ablösen kann. Andernfalls kann Serum das Trypsin inaktivieren.

Warum waschen Sie die Zellen mit PBS, bevor Sie Trypsin hinzufügen??

Bevor Sie es zu den Zellen hinzufügen, müssen Sie das Zellkulturmedium abwaschen, da Trypsin auch Proteine, die in den Medien vorhanden sind, wie FCS, abbauen und seine Aktivität verringern würde, bevor es die Zellen erreicht.