Herausforderungen bei der Rna-Extraktion

Fehlerbehebungshandbuch für die vollständige RNA-Extraktion & Reinigung

1. Was verursacht RNA-Abbau??
2. Wie kann die RNA-Extraktion verbessert werden??
3. Warum ist RNA schwerer zu extrahieren als DNA??
4. Wie können Sie eine DNA-Kontamination während der RNA-Isolierung verhindern??
5. Wie können wir RNA vor Abbau schützen??
6. Zerstört das Autoklavieren die RNA??
7. Wie friert man Zellen für die RNA-Extraktion ein??
8. Wie werden Sie RNA los??
9. Wie funktioniert die RNA-Extraktion??
10. Warum bei der RNA-Extraktion flüssiger Stickstoff verwendet wird?
11. Was ist der Zweck der RNA-Extraktion?
12. Was ist eine gute RNA-Ausbeute??

Was verursacht RNA-Abbau??

Es gibt zwei Hauptgründe für den RNA-Abbau während der RNA-Analyse. Erstens ist RNA aufgrund ihrer Struktur von Natur aus schwächer als DNA. ... Dies macht RNA chemisch labiler als DNA. RNA ist auch anfälliger für Wärmeabbau als DNA.

Wie kann die RNA-Extraktion verbessert werden??

Es gibt 3 effektive Methoden, um dies zu erreichen:

1. Die Proben werden unmittelbar nach der Ernte in einer Zelllyselösung auf chaotroper Basis (z. B. Guanidinium enthaltend) wie dem im PureLink RNA Mini Kit oder TRIzol Reagent verfügbaren Lysepuffer gründlich homogenisiert.
2. Flash-Freeze-Proben in flüssigem Stickstoff.

Warum ist RNA schwerer zu extrahieren als DNA??

Der Hauptgrund ist, dass RNA im Vergleich zu DNA weniger stabil und leichter abzubauen ist. ... RNA hat größere Rillen als DNA, was es einfacher macht, von Enzymen angegriffen zu werden. Enzyme, die RNA und Ribonukleasen (RNasen) abbauen, sind in der Umwelt reichlich vorhanden und schwer vollständig zu entfernen.

Wie können Sie eine DNA-Kontamination während der RNA-Isolierung verhindern??

Das Problem kann manchmal vermieden werden, indem Primer auf Introngrenzen beschränkt werden. Dies ist jedoch häufig schwierig, und die derzeit verwendeten Methoden zur Verringerung der DNA-Kontamination umfassen den DNAse I-Verdau, die Gelfraktionierung, die Extraktion von saurem Phenol: Chloroform und die Fällung von Lithiumchlorid.

Wie können wir RNA vor Abbau schützen??

Um einen Abbau zu verhindern, werden RNA-Proben im Allgemeinen gefroren bei –20 ° C oder –80 ° C oder unter flüssigem Stickstoff gelagert.

Zerstört das Autoklavieren die RNA??

Stellen Sie sicher, dass Sie die für die RNA-Arbeit verwendeten Reagenzien von den "Reagenzien für den allgemeinen Gebrauch" im Labor trennen. Alle Lösungen mit Ausnahme der Tris-Puffer sollten über Nacht bei Raumtemperatur mit 0,1% DEPC (oder DMPC) behandelt und dann autoklaviert werden. Das Autoklavieren hydrolysiert und zerstört nicht umgesetztes DEPC und DMPC.

Wie friert man Zellen für die RNA-Extraktion ein??

Legen Sie das Gewebe in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen oder 15 ml konisches und frieren Sie es auf Trockeneis ein. Alternativ können Sie das Gewebe in Aluminiumfolie einwickeln und mit flüssigem Stickstoff einfrieren.

Wie werden Sie RNA los??

Die RNA-Kontamination kann durch Zugabe von 2 Mikrolitern RNase A (10 mg / ml, Fermentas) zu 20 Mikrolitern DNA, gelöst in TE-Puffer (Tris-EDTA, pH = 8,0), entfernt und 3–4 h bei 37 ° C inkubiert werden.

Wie funktioniert die RNA-Extraktion??

Organische Extraktionsmethoden

Während der Zentrifugation trennt sich die Probe in drei Phasen: eine untere organische Phase, eine mittlere Phase, die denaturierte Proteine ​​und gDNA enthält, und eine obere wässrige Phase, die RNA enthält. Die obere wässrige Phase wird gewonnen und die RNA durch Alkoholfällung und Rehydratisierung gesammelt.

Warum bei der RNA-Extraktion flüssiger Stickstoff verwendet wird?

Flüssiger Stickstoff wird verwendet, da er eine sehr niedrige Temperatur von -176 ° C hat, die dazu beiträgt, die harte Substanz von pflanzlichem und tierischem Gewebe zu Staub zu pulverisieren. Es hilft auch bei der Deaktivierung der DNAase, um die DNA zu verdauen .

Was ist der Zweck der RNA-Extraktion?

RNA-Extraktion ist die Reinigung von RNA aus biologischen Proben. Dieses Verfahren wird durch das allgegenwärtige Vorhandensein von Ribonukleaseenzymen in Zellen und Geweben erschwert, die RNA schnell abbauen können.

Was ist eine gute RNA-Ausbeute??

Ein A.₂₆₀/EIN₂₈₀ Ein Verhältnis von mehr als 1,8 wird normalerweise als akzeptabler Indikator für qualitativ hochwertige RNA mit einer geringen Proteinkontamination angesehen [14, 15]. Ein A.₂₆₀/EIN₂₃₀ Ein Verhältnis von mehr als 1,8 wird als Indikator für extrahierte RNA mit einem geringen Grad an Polysaccharidkontamination verwendet.